金黄色葡萄球jun杀灭率测试技术指南：从方法验证到效果评价

一、标准与法规依据

1. 国内核心标准

GB/T 27947-2020《消毒剂杀灭微生物效果评价方法》：规定悬液定量法、载体定量法等测试流程，金黄色葡萄球jun杀灭率≥99.9%为消毒合格。

GB 15981-2012《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》：明确医疗机构使用的消毒剂需达到杀灭率≥99.999%的灭菌要求。

GB 27951-2011《皮肤消毒剂卫生要求》：适用于手消毒剂、皮肤黏膜消毒剂的金黄色葡萄球jun杀灭效果评价。

2. 国际方法对比

AOAC 966.04：采用悬液法测试化学消毒剂对金黄色葡萄球jun的杀灭活性，作用时间通常为30秒至10分钟。

EN 13704：欧洲标准，要求载体法测试中杀灭率达到99.999%，且需通过中和剂验证和有机物干扰试验。

二、测试原理与菌株准备

1. 菌株特性与培养

标准菌株：金黄色葡萄球junATCC 6538（凝固酶阳性，具有β-溶血活性），购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

复苏与培养：

1.从冻干管取少量菌粉接种于营养琼脂斜面，37℃培养24小时；

2.挑取单个菌落接种至营养肉汤，37℃振荡培养18小时至对数生长期（OD600=0.5，活菌浓度约10?CFU/mL）。

2. 菌悬液制备

稀释步骤：取1mL菌液加入9mL 0.03mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2），梯度稀释至10?-10?CFU/mL，备用。

浓度验证：取0.1mL稀释菌液涂布营养琼脂平板，培养后计数，确保浓度符合试验要求。

三、关键测试方法与步骤

1. 悬液定量杀菌试验

（1）中和剂筛选（关键前验证）

目的：消除消毒剂残留对活菌计数的干扰，确保结果准确。

方法：采用稀释法测试3种中和剂浓度（0.1%、0.5%、1%硫代liu酸钠），选择能wan全中和且对菌株无毒性的配方。

判定标准：中和剂对照组菌落数与阴性对照组差异≤10%，且中和产物无抑菌作用。

（2）杀菌处理与活菌计数

操作流程：

1.试验组：取0.5mL菌悬液+4.5mL消毒剂（如含氯消毒剂500mg/L），20℃水浴作用指定时间（1min、5min、10min）；

2.中和终止：立即取0.5mL混合液加入4.5mL中和剂，混匀后静置10分钟；

3.活菌计数：取0.1mL中和后液体涂布营养琼脂平板，37℃培养48小时，计数菌落（结果以CFU/mL表示）。

对照组设置：

阳性对照：菌悬液+PBS（无消毒剂）

阴性对照：消毒剂+中和剂（无菌悬液）

2. 载体定量杀菌试验（模拟实际应用场景）

载体选择：不锈钢片（1cm×1cm，经脱脂灭菌）或玻璃片，适用于表面消毒产品测试。

试验步骤：

1.载体接种：取10μL菌悬液滴加于载体表面，37℃干燥30分钟（形成菌膜）；

2.消毒处理：将载体wan全浸泡于消毒剂中，设定作用时间后取出，转移至中和剂中超声洗脱（功率300W，时间1分钟）；

3.结果计算：洗脱液倾注平板培养，按公式计算杀灭率：

4.杀灭率（%）=（对照组平均活菌数-试验组平均活菌数）/对照组平均活菌数×100%

四、结果判定与影响因素

1. 合格标准

消毒产品：作用时间内杀灭率≥99.9%（如手消毒剂作用30秒）；

灭菌产品：杀灭率≥99.999%（如手术器械消毒剂作用15分钟）；

特殊场景：医疗机构高风险区域使用的消毒剂需达到≥99.9999%杀灭率。

2. 关键影响因素

温度：试验温度控制在20±1℃，温度升高可加速杀菌（如37℃下杀灭率比20℃提高2倍）；

pH值：含氯消毒剂在pH 6-7时杀菌效果为佳，碱性条件下稳定性增强但杀菌活性下降；

有机物干扰：加入1%-5%小牛血清模拟体液污染，可使杀灭率降低1-2个数量级，需在报告中注明。

五、典型案例分析

案例1：含氯洁厕剂杀菌效果验证

测试条件：消毒剂浓度500mg/L，作用时间5分钟，悬液法测试。

结果：

对照组活菌数：3.2×10?CFU/mL

试验组活菌数：28 CFU/mL

杀灭率=（3.2×10?-28）/3.2×10?×100%=99.99%（符合GB 27951要求）

案例2：中和剂选择不当导致结果偏差

问题：使用0.1%硫代liu酸钠中和过氧乙酸消毒剂，中和不wan全。

现象：试验组活菌数为0 CFU/mL，杀灭率100%，但中和剂对照组菌落数显著低于阳性对照（差异＞30%）。

改进：更换为0.5%硫代liu酸钠+0.5%吐温80复合中和剂，结果恢复正常。

六、质量控制与注意事项

1. 试验全程质控措施

菌株质控：每批次试验前验证菌株纯度（革兰氏染色镜检）和活性（生长曲线测定）；

平板计数质控：同一稀释度做2个平行平板，菌落数差异≤15%，取平均值计算；

环境控制：生物安全柜内操作，避免交叉污染，试验温度波动≤±1℃。

2. 常见问题解决方案

菌落蔓延：可在培养基中加入0.1%TTC（氯化三苯四氮唑），使菌落显色便于计数；

消毒剂稳定性：含氯消毒剂需现配现用，作用过程中监测有效氯浓度（如使用DPD比色法）。

七、中科检测技术优势

1.全方法覆盖：具备悬液法、载体法、现场模拟试验等完整测试能力，CNAS认可参数覆盖国内外主流标准。

2.快速检测服务：提供24小时加急服务，3天出具初步结果，满足企业产品上市前验证需求。

3.定制化方案：针对特殊产品（如湿巾、凝胶消毒剂）开发专属测试流程，解决复杂基质干扰问题。

注：常规测试周期为5-7个工作日，报告包含中和剂验证数据、杀灭率计算过程及结果判定，可直接用于消毒产品备案和市场监管部门抽检。